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빠르고 클로닝 효율을 높일 수 있는 Single Cell Dispenser

2021-09-16 09:38:02

 

 

미세 유체 시스템 (Microfluidics)으로 빠르고 간편하게

Single Cell을 당신의 Benchtop에서 분주하세요!



Cell Line Development 

 

차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주는 치료 항체 생산에 널리 사용됩니다. 일반적인 세포주 개발 워크플로우에서 CHO 세포는 IgG 발현 벡터로 형질주입됩니다. 단일 형질주입된 CHO 세포는 클론 확장을 위해 분리되고 고역가 클론은 성장 후 ELISA를 통해 확인됩니다. 이러한 고생산 세포주는 대규모 항체 생산을 위해 확장됩니다.치료 항체를 위한 세포주를 생성하려면 클론 세포 집단이 필요합니다. CHO 클로닝을 위한 단일 세포의 분리는 전통적으로 FACS 또는 제한 희석을 사용하여 수행되었으며, 각각 고유한 단점이 있습니다.FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorters)는 매우 높은 압력(최대 70psi)에서 세포를 분류합니다. 이는 세포에 가혹하고 세포 생존율을 감소시킵니다. 이 기계는 또한 사용하기가 매우 어렵고 교차 오염 및 막힘이 발생하기 쉽습니다.제한 희석은 FACS보다 부드럽지만 시간이 많이 걸리고 노동 집약적이며 단일 세포 분리 효율이 매우 낮습니다(푸아송 분포에 의해 빈 웰 및 이중선이 보장됨). 따라서 이 접근 방식은 매우 비효율적이고 비용이 많이 듭니다. 

 

 

 

 

 

차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주는 치료 항체 생산에 널리 사용됩니다.
CHO 세포는 대량 생산을 위해 원하는 단백질을 암호화하는 플라스미드로 형질주입됩니다.
형질주입된 세포는 Namocell 독점 미세유체 세포 카트리지 하나에 로드되고 96- 또는 384-well plate 분주됩니다. ELISA 통해 콜로니를 분석하여 항체 역가를 결정합니다.

 

 

 

 

Dispensing Efficiency


 

 Namocell single cell dispenser 수동 파이펫팅(~30%) 비해 단일 세포(포유류 세포의 경우 80-90%) 분리하는 매우 효율적이고 재현성이 높습니다.


 

Cloning Efficiency

 

  

 

Namocell single cell dispenser로 분리된 세포는 기존방식인 한계희석법 (LDC )및 FACS보다 높은 클로닝 효율을 보였습니다.

 

 

 

 

 

Comparison of single cell dispensing efficiency between Namocell Single Cell Dispenser and limiting dilution method. 

 

 

 단일 세포를  조직 배양 plate 에 안정적으로 침적시키는 것(well 당 세포 하나)은 clonal cell의 분리 및 성장을 위한 필수적인 고려 사항입니다. 기존의 한계희석법( manual limiting dilution)의  세포 침적의 효율성은 본질적으로 포아송 분포에 의해 제한되므로 소모품 및 시간의 낭비를 피할 수 없습니다. Namocell의 single cell dispenser는  단일 세포 분리를 위해 빠르고 신뢰할 수 있는 대안을 제공하며, < 2psi의 압력으로 분류하여 세포 상태를 유지할 수 있습니다.

 

 

 

 

 
본 실험에서는 먼저 fluorescent calibration particles (beads)의 침적을 통해 Namocell의 분사 효율성을 보여주었고 Namocell의 dispenser와 manual limiting dilution 간에 단일 CHO 세포의 침적을  비교하였습니다.
 


A selective FACS-enrichment was performed via the enrichment mode of Namocell Single Cell Dispenser to enrich for high titer CHO cells.
 

 

 단일 클론 바이오의약품 생산에 필요한 세포주 개발은 형질 주입된 수백 개의 클론을 모니터닝해야하는 어려움이 있었습니다. Namocell의 single cell dispenser는 2psi 미만의 안전한 압력에서 작동하며, 분리 후 클론의 생존력을 유지할 수 있습니다. 또한 Namocell의 독점 기술인 농축 sorting 모드는 초당 최대 50,000개의 세포를 처리하여 수백만 개의 세포를 신속하게 screening하고 1% 미만으로 발생하는 rare event를 효율적으로 분리할 수 있습니다.

 

 

 
일반적으로 대부분 낮거나 중간정도의 생산량을 가진 클론들로 구성되며, 생산량이 높은 클론의 비율은 상대적으로 적습니다. 최근에는 fluorescence activated cell sorting (FACS)는 형광물질로 tag된 표면 마커에 기반하여 높은 생산량을 보이는 클론의 분리가 가능하게 함으로써 처리량을 향상시켰습니다.

이 방법의 한계점은 종종 세포의 생존력을 감소시키는 high-pressure cell sorter (20~70 psi)에 의존한다는 것이고, 높은 dead volume 때문에 rare frequency (1-3% 미만)의 하위 집단의 분리에는 적합하지 않다는 것입니다.

본 실험에서는 Namo single cell dispenser를 사용하여 형광으로 표지된 생산량이 높은 클론들을 선택적으로 분주시킴으로써 high titer CHO cells를 분리하였습니다.
 

 

 

클론 GFP 세포주를 생성하려면 일반적으로 먼저 cell sorter로 GFP 양성 세포를 분류해야 합니다. GFP 양성 세포는 분류과정에서 발생하는 스트레스로부터 회복하기 위해 며칠 동안 배양됩니다. 클론 GFP 세포는 최종적으로 웰 당 하나의 세포에서 희석을 제한하여 얻습니다.  본 실험에서는  Namocell Single Cell Dispenser를 사용하여 단일 GFP 양성 세포를 96well plate에  직접 분리했습니다. Namocell Single Cell Dispenser의 낮은 선별 압력으로 인해 하나의 과정으로  clonal GFP 세포주 생성 가능합니다. 

 

 

 
 Fluorescent reporter 구조는 cell line 엔지니어링을 위한 강력한 기술로써, 형질주입된 세포를 쉽게 찾아낼 수 있습니다. Transfection 이후, reporter로 표지된 단일 세포들은 일반적으로 클론 배양 및 recombinant product 생성을 위해 분리됩니다. 기존의  클론 엔지니어링 cell line의 생성은 두 단계의 과정을 수반하는데, 형광 세포들은 먼저 cell sorter를 사용하여 pool로 농축된 다음 manual limiting dilution를 사용하여 단일 클론으로 분리됩니다. 이 워크플로우는 시간이 많이 걸릴 뿐만 아니라 각 단계에서 한계점을 가지고 있습니다. high pressure sorting(20-70psi)로 인해 첫 번째 단계에서 세포가 쉽게 손상될 수 있고 두 번째 단계의 outgrowth 효율은 포아송 분포에 의해 제한되므로 실행 가능한 클론의 수가 상대적으로 적습니다. Namocell의  singlec cell dispenser는 분류된 세포의 무결성과 생존성을 보존하기 위해 저압(<2psi)에서 작동하는 사용자 친화적인 벤치탑 기술입니다. 이러한 시스템의 형광 검출 기능을 통해 transfect된 세포를 쉽게 분리할 수 있어 한 번에 복제 cell line을 생성할 수 있습니다.
 



 

Namocell의 single cell dispenser는 Cell viability를 유지하면서 효율적으로 single cell을 분리할 수 있으며, 교체형 카트리지 사용으로 샘플간 교차오염을 방지합니다.



 

The Fastest Way to a Single Cell

Hana and Pala Single Cell Dispensers